经方茵陈蒿汤的化学研究(3)

　方法:采用双向凝胶电泳技术分离正常组、2周模型组、4周模型组、茵陈蒿汤组、一贯煎组、黄芪汤组、下瘀血汤组、小柴胡汤组肝组织总蛋白质，获得的2-D凝胶采用考马斯亮蓝显色、通过ImageScanner扫描仪扫描获取图像，再经软件进行图像分析并识别差异蛋白点，采用MALDI-TOF/TOF-MS质谱技术和Mascot搜索软件鉴定差异蛋白质，并在SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库中确定所鉴定的蛋白质的功能。
　结果:
　1、双向凝胶电泳图谱的建立
　建立了正常组、2周模型组、4周模型组、茵陈蒿汤组、一贯煎组、黄芪汤组、下瘀血汤组、小柴胡汤组大鼠肝组织总蛋白质的2-DE图谱。各组大鼠肝组织检测到的平均蛋白质点数分别为:正常组1128个，2周模型组1113个，4周模型组1130个，茵陈蒿汤组1115个，黄芪汤组1132个，下瘀血汤组1135个，一贯煎组1127个，小柴胡汤组1037个。与参考胶匹配率分别为:78.15％、81.22％、82.65％、80，18％、83，23％、78.94％、79.64％0
　2、差异蛋白点
　与正常组比较，2周模型组有78个蛋白质点上调，有89个蛋白质点下调；4周模型组有59个蛋白质点上调，有113个蛋白质点下调。
　与4周模型组比较，茵陈蒿汤组有60个蛋白质点上调、56个蛋白质点下调，黄芪汤组有51个蛋白质点上调、90个蛋白质点下调，小柴胡汤组有48个蛋白质点上调、33个蛋白质点下调，一贯煎组有57个蛋白质点上调、74个蛋白质点下调，下瘀血汤组有62个蛋白质点上调、98个蛋白质点下调。
　3、差异蛋白质的质谱鉴定及其在各组中的表达情况
　筛选出50个差异蛋白点做质谱鉴定。已知功能明确的蛋白质44个。
　(1)与正常组比较，模型组中表达上、下调的蛋白分别有21、22个，功能涉及氧化应激及线粒体氧化磷酸化(谷胱甘肽S-转移酶、DJ-1protein、铜/锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽合成酶、醛酮还原酶7A2、泛醌细胞色素c还原酶铰链蛋白、24-kDa线粒体NADH脱氢酶前体)、细胞骨架(原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、加帽蛋白α2、γ肌动蛋白、层粘连蛋白受体1、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18)、细胞增殖与凋亡(热反应蛋白12、翻译控制肿瘤蛋白1、MAWDBP、蛋白酶体亚基α5、26S蛋白酶调节亚基6A)、神经系统发育(唐氏综合症临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1、脑脂结合蛋白)、神经传导(儿茶酚邻甲基转移酶抑制剂、γ-氨基丁酸受体p2亚基)、基因表达调控(转录调节因子1-β、翻译延伸因子1-β)、物质转运(白蛋白、α-2u球蛋白、α-2u-球蛋白前体)、物质代谢(亮氨酸氨基肽酶、二甲基精氨酸氨基水解酶1、精胺脲水解酶、2-氧异戊酸脱氢酶亚基α、半乳糖激酶1、果糖-1，6-二磷酸酶1、前列腺素还原酶、促肥大反应蛋白)、免疫与炎症(补体衰变加速因子、二肽基肽酶I)、生物转化(磺基转移酶1C1、D-多巴色素异构酶)等。
　(2)茵陈蒿汤对模型组有显著调节作用的蛋白质，主要涉及细胞增殖与凋亡(热反应蛋白12、唐氏综合症临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1、翻译控制肿瘤蛋白1、MAWDBP)、氨基酸代谢(支链酮酸脱氢酶E1、精胺脲水解酶、亮氨酸氨基肽酶、翻译延伸因子)、氧化应激(醛酮还原酶7A2，DJ-1蛋白，铜/锌超氧化物歧化酶)等功能，
　(3)黄芪汤对模型组有显著调节作用的蛋白质，主要涉及细胞分化(转录调节因子1β、脑脂结合蛋白)，神经传导(γ-氨基丁酸受体p2亚基、儿茶酚邻甲基转移酶抑制剂)、细胞骨架(原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、γ肌动蛋白、细胞角蛋白18)、脂糖代谢(促肥大反应蛋白、半乳糖激酶1、果糖-1，6-二磷酸酶1)、氧化应激(谷胱甘肽S-转移酶Yb-1亚基，DJ-1蛋白，铜/锌超氧化物歧化酶)等功能。
　结论:
　(1)二甲基亚硝胺大鼠肝硬化形成的病理生物学变化主要表现为氧化应激与线粒体的损伤，肝内细胞的增殖、分化及凋亡的异常，神经递质、脂类、糖类代谢的异常以及蛋白质、氨基酸代谢的降低等诸多环节；
　(2)调控细胞的异常增殖与凋亡以及抗氧化应激损伤是茵陈蒿汤抑制DMN大鼠肝硬化形成，改善蛋白质、氨基酸代谢的效应基础；
　(3)抑制细胞异常分化、抗氧化应激及线粒体损伤是黄芪汤减缓肝纤维化进程，改善神经递质、脂肪及糖代谢异常的主要作用环节。4.期刊论文王磊.刘平.慕永平.刘成清热利湿与益气古典方剂逆转二甲基亚硝胺大鼠肝硬化的细胞生物学基础研究-自然科学进展2007,17(8)探讨了清热利湿的茵陈蒿汤与益气的黄芪汤逆转二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)大鼠肝硬化的细胞生物学基础.采用0.5%DMN生理盐水溶液4周12次腹腔注射法制备大鼠肝硬化模型,造模成型后终止DMN刺激,分组予以不同功效方剂经口给药2周,获取样本作相关指标的检测.TUNEL染色原位检测肝细胞凋亡并计算凋亡指数,免疫组织化学及Westernblot方法分别检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、肝细胞生长因子α(hepaticgrowthfactor-α,HGF-α)、CD68及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶2,9(MMP-2、MMP-9)的活性.与正常大鼠比较,模型大鼠肝细胞凋亡指数、CD68及α-SMA表达均显著增加,而HGF-α与MMP-13表达显著减少(P＜0.01或＜0.05);与同期模型对照组大鼠相比,茵陈蒿汤组大鼠肝细胞凋亡指数显著降低,CD68与MMP-13表达显著增加(P＜0.01,P＜0.05),黄芪汤组无显著变化;茵陈蒿汤组MMP-9活性显著增加(P＜0.01)、而黄芪汤组显著降低(P＜0.05);茵陈蒿汤组及黄芪汤组大鼠肝组织α-SMA表达均显著降低(P＜0.01),而黄芪汤组显著低于茵陈蒿汤组(P＜0.05),黄芪汤组大鼠肝组织HGF-α表达显著增加(P＜0.05),MMP-2活性显著降低(P＜0.05).这表明逆转DMN大鼠肝硬化的有效方剂具有不同的细胞生物学基础:茵陈蒿汤清热利湿的祛邪作用在于减少肝实质细胞的病理性凋亡、调控库普弗细胞功能;黄芪汤益气的扶正功效主要表现为抑制肝星状细胞活化及促进肝窦内皮细胞损伤的修复.5.期刊论文王磊.刘平.王春树.慕永平.龙爱华不同功效古典方剂对肝硬化大鼠肝组织氧化应激反应的影响-中国中西医结合杂志2008,28(5)目的比较5首不同功效古典方剂逆转二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝硬化的抗肝组织氧化应激效应.方法4周内给大鼠腹腔注射DMN12次制备肝硬化模型,成模后停止染毒,随机分为模型对照组、一贯煎组、黄芪汤组、茵陈蒿汤组、下瘀血汤组及小柴胡汤组,分别以生理盐水或相应药物灌胃给药2周;检测各组大鼠肝组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)活性及丙二醛(MDA)含量及血清肝功能、肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量的变化.结果与正常组比较,模型大鼠肝组织GST活性及MDA含量显著升高,分别于造模2周末(肝纤维化形成期)、4周末(肝硬化形成)达到高峰,而T-SOD及GSH-Px活性显著降低;与6周模型组比较,黄芪汤组和茵陈蒿汤组大鼠肝硬化明显减轻,肝组织MDA含量及GST活性显著下降,T-SOD活性显著升高.结论氧化应激是DMN诱导大鼠肝硬化形成的重要病理环节,抗氧化应激效应是茵陈蒿汤和黄芪汤逆转大鼠肝硬化的主要机制之一.茵陈蒿汤的祛邪作用重在清除脂质过氧化物等病理因子,黄芪汤的扶正效应重在提高机体内在的抗氧化能力.6.期刊论文慕永平.刘平.王磊茵陈蒿汤的发展及现代研究-中国实验方剂学杂志2006,12(2)综述了茵陈蒿汤的发展及研究现状,自仲景以来,历代将茵陈蒿汤化载用于治疗各类黄疸性疾病,现代研究表明,茵陈蒿汤不仅具有促进胆红素代谢的作用,还具有抗肝损伤,抑制肝细胞凋亡、抑制星状细胞活化及胶原合成等作用,其作用的物质基础主要为6,7-二甲基香豆素、都桷子素及大黄素等,并进一步明确了一些有效组分的作用靶点.7.会议论文许慎吾仲景方剂在病毒性肝炎中应用举隅2001病毒性肝炎分属中医"黄疸"、"胁痛"、"虚劳"等范畴.不同类型肝炎症状各有差异,究其病因,有三个必具条件:湿、血分、肝.

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